Sabtu, 14 April 2012

Isolasi Gen Resisten terhadap Penyakit CVPD

Isolasi Gen Resisten terhadap Penyakit CVPD

Gen resisten dapat diisolasi dari tanaman jeruk yang tahan terhadap serangan penyakit CVPD
Isolasi Gen dapat dilakukan dengan metode T-DNA Tagging menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens
Transformasi genetic pada tanaman jeruk dapat dilakukan secara in vitro dan in planta
Berbagai jenis tanaman jeruk yang dibudidayakan secara ekonomis diketahui peka terhadap serangan penyakit CVPD. Jenis-jenis tanaman jeruk budidaya yang peka terhadap serangan cvpd untuk selanjutnya disebut tanaman jeruk CVPDs. Tanaman jeruk Garut dan jeruk Tejakula yang sangat terkenal sekarang sudah sangat sulit ditemukan di lapangan dan kalaupun ditemukan telah terinfeksi berat oleh penyakit CVPD. Dewasa ini belum ditemukan cara pengendalian penyakit cvpd ini secara baik, karena berbagai kendala yang masih dihadapi seperti: belum dapat dibiakkannya patogen penyebab penyakit pada media buatan, sehingga sulit untuk melakukan karakterisasi terhadap sifat-sifat patogennya akibatnya sulit untuk mengetahui mekanisme infeksi tanaman oleh patogen yang pada akhirnya sulit untuk merumuskan teknik pengendaliannya.
Sebaliknya, telah dilaporkan bahwa beberapa jenis tanaman jeruk, terutama tanaman jeruk yang tidak dibudidayakan secara ekonomis dan beberapa tanaman kerabatnya, diketahui ada yang toleran (tahan) terhadap penyakit CVPD. Jenis tanaman jeruk dan kerabatnya yang toleran (tahan) CVPD ini untuk selanjutnya disebut tanaman jeruk CPVDr. Diantaranya “Seedless lime” (jeruk nipis tanpa biji), Tahiti lime, Triphachia trifoliata (jeruk kinkit), dan Poncirus trifolia (karatachi). Tanaman jeruk yang toleran (tahan) terhadap CVPD (CVPDr) diyakini mengandung gen atau gen-gen yang produknya mampu mematahkan infeksi oleh patogen CVPD (L. asiaticum) atau mampu menolak penularan patogen yang dibawa oleh serangga vektor D. citri.
Berdasarkan informasi ini, pertama; Wirawan, dkk, 2000, menguji ulang ketahanan terhadap CVPD dari beberapa jenis tanaman CVPDr dengan cara penularan penyakit menggunakan vektor serangga Diaphorina citri. Seleksi dilakukan secara sangat ketat yaitu baik secara visual dengan mengamati gejala yang muncul maupun menggunakan deteksi PCR (Polimerase Chain Reaction) terhadap keberadaan patogen pada tanaman yang diuji. Kemudian dari tanaman-tanaman CVPDr yang terseleksi dilakukan mutasi, dengan metode transformasi menggunakan sistem Agrobacterium tumefaciens baik secara in vitro maupun secara in planta.
Secara in vitro transformasi genetik dilakukan melalui kultur sel, potongan daun, ruas ranting muda (internode stem), biji, dan potongan kecambah steril dari tanaman CVPDr (dalam hal ini digunakan jeruk kinkit dan karatachi). A. tumefaciens LBA (pAL4404, pIB121) diinokulasi pada bahan-bahan tanaman tersebut untuk kemudian ditumbuhkan pada media kultur jaringan (MTO atau MTOK). Transformasi secara in planta dilakukan dengan menginokulasi A. tumefaciens LBA (pAL4404, pIB121) pada pucuk tunas yang dipotong pada bibit muda tanaman jeruk kinkit atau karatachi.
Ti Plasmid biner pIB121, mengandung fragmen DNA yang terdiri dari gen untuk ketahanan terhadap kanamisin, dan gen ß-glucuronidase (GUS) yang diklon bagian “downstream” 35S CaMV promoter-nya (Jefferson, et al, 1987; Ohta, et al, 1990; Wirawan and Kojima, 1996). A. tumefaciens akan mentransfer fragmen DNA ini ke dalam sel-sel tanaman jeruk kinkit atau karatachi yang dapat dideteksi dengan media seleksi yang mengandung kanamisin, dan dengan deteksi PCR menggunakan sekuen gen GUS sebagai primernya, serta dengan cara mendeteksi ekspresi gen GUS pada transforman yang dihasilkan. Mutasi dengan sistem A. tumefaciens pada genom tanaman CVPDr (kinkit atau karatachi) menonaktifkan gen-gen yang termutasi yang diantaranya adalah gen atau gen-gen yang bertanggungjawab pada toleransi (ketahanan) tanaman terhadap serangan penyakit CVPD. Dengan demikian loci gen-gen ini dapat diidentifikasi dan diisolasi serta dapat klon untuk dikharakterisasi sifat-sifatnya dan dimanfaatkan dalam penanganan penyakit CVPD.
Transforman atau mutan tanaman jeruk CVPDr yang dihasilkan, diinokulasi dengan Diaphorina citri infektif (membawa bakteri L. asiaticum, penyebab CVPD). Mutan-mutan yang menunjukkan gejala serangan CVPD (disebut CVPDr-s) diseleksi, dan keberadaan L. asiaticum pada mutan tanaman jeruk CVPDr-s dideteksi dengan metode PCR menggunakan sekuen 16S ribosomal DNA yang spesifik untuk L. asiaticum sebagai primer. Loci gen-gen yang tahan CVPD diisolasi dari mutan tanaman CVPDr-s ini menggunakan metode inverse PCR (IPCR) atau plasmid rescue.
Wild type target DNA dari tanaman induk dideteksi dan diisolasi menggunakan metode PCR menggunakan primer yang dirumuskan berdasarkan sekuen dari flanking DNA produk IPCR. Konfirmasi terhadap hasil PCR ini dilakukan dengan metode Southern Blot menggunakan fragmen flanking DNA atau produk PCR diatas sebagai probe.
Penelitian dilakukan berdasarkan pengalaman penelitian sebelumnya dalam mentrasfer gen acvB yang diisolasi dari khromosom A. tumefaciens strain A208 (DDBJ accession number D13800 (Wirawan, et al, 1993) ke dalam sel-sel tanaman tembakau dan tomat dapat menunjukkan hasil yang sangat baik. Disamping itu hasil penelitian Moore dan kawan-kawan menunjukkan bahwa transformasi tanaman jeruk menggunakan sistem Agrobacterium ini dapat berhasil dengan baik (Moore, et al, 1992).
Uji ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD
Beberapa jenis tanaman jeruk dan kerabatnya diuji ulang ketahanan atau kepekaannya terhadap serangan penyakit CVPD. Beberapa tanaman ini sebelumnya dilaporkan memiliki sifat toleran (tahan) terhadap serangan penyakit CVPD (De Lange, et al, 1985; Nariani, 1981; Tirtawidjaya, 1981). Hampir semua tanaman yang diuji menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD artinya tidak tahan terhadap penyakit CVPD, seperti yang ditunjukkan oleh tanaman Kemuning (Murraya Paniculata), jeruk siem Kintamani, jeruk keprok Tejakula, Nagami kinkan, Sour Orange dan lainnya. Analisis PCR untuk mendeteksi patogen penyebab penyakit CVPD memastikan bahwa tanaman-tanaman tersebut peka terhadap serangan penyakit CVPD. Tanaman jeruk kinkit, jeruk nipis tanpa biji dan karatachi (Poncirus trifolia) menunjukkan ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD. Sehingga kemudian diputuskan untuk memilih jeruk kinkit dan karatachi sebagai tanaman toleran yang diteliti lebih lanjut.
Kemuning (Murraya paniculata) bahkan sangat disenangi oleh serangga vektor D. citri dan menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD lebih cepat dibandingkan dengan tanaman lainnya. Sehingga kemuning banyak digunakan sebagai tanaman indikator dan tanaman yang digunakan untuk memelihara serangga vektor D. citri.

Gambar 1. Jenis-jenis tanaman jeruk yang diuji ketahanannya terhadap penyakit CPVD.

Gambar 2. Analisis PCR tanaman-tanaman yang diuji ketahanannya terhadap serangan penyakit CPVD. 1. Marker DNA, 2. DNA dari tanaman jeruk sehat, 3. DNA dari tanaman jeruk sakit, 4. DNA dari tanaman kemuning yang menunjukkan gejala, 5. DNA dari tanaman Sour Orange yang menunjukkan gejala, 6. DNA dari tanaman Nagami Kinkan yang menunjukkan gejala, 7.DNA dari tanaman jeruk Kinkit, dan DNA dari tanaman jeruk nipis tanpa biji.

Gambar 3. Tanaman jeruk Kinkit dan Jeruk Nipis yang diujikan.
Tahap-Tahap Prosedur Isolasi Gen Resisten Penyakit CVPD
  1. Uji ketahanan tanaman jeruk kinkit dan karatachi serta tanaman jeruk budidaya (siem dan keprok) terhadap serangan penyakit CVPD dengan cara penularan mengunakan serangga vektor D. citri
  2. Deteksi PCR untuk memastikan serangan penyakit CVPD pada tanaman yang diuji.
  3. Jeruk kinkit dan karatachi dipilih sebagai tanaman yang toleran terhadap serangan penyakit CVPD (CVPDr)
  4. Transformasi genetik secara in vitro atau in planta pada tanaman jeruk kinkit dan karatachi
  5. Seleksi transforman (tanaman yang termutasi)
  6. Uji ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD untuk tanaman-tanaman termutasi (transforman)
  7. Seleksi yang menjadi peka terhadap serangan penyakit CVPD (CVPDr-s)
  8. Inverse PCR (IPCR) untuk isolasi flanking DNA termutasi dari mutan tanaman jeruk kinkit CVPDr-s.
  9. Kloning produk IPCR (flanking DNA termutasi) pada vektor plasmid
  10. Sekuen fragmen DNA produk IPCR
  11. Formulasi primer untuk deteksi wild type target DNA yang mengandung gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD
  12. Deteksi dan isolasi serta kloning wild type target DNA yang mengandung gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD
  13. Analisis sekuen klon wild type target DNA yang mengandung gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD dan penentuan ORF (open reading frame) dari gen gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD (gen CVPDr)
  14. Over expression (produksi protein) gen CVPDr pada sel Escherichia coli
  15. Analisis fungsi protein yang dihasilkan oleh gen CVPDr dalam mekanisme ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit CVPD
  16. Pembuatan tanaman jeruk transgenik menggunakan gen CVPDr
  17. Uji ketahanan tanaman jeruk transgenik dengan gen CVPDr terhadap serangan penyakit CVPD

Gambar 4. Metode mutasi dengan TDNA Tagging untuk mendapatkan tanaman jeruk Kinkit yang menjadi tidak tahan terhadap penyakit CPVD. Click disini untuk animasi gambar 4.

Gambar 5. Regenerasi mutan tanaman jeruk CVPDr-s dengan metode transformasi Agrobacterium tumefaciens. Click disini untuk animasi gambar 5.

Gambar 6. Uji ketahanan terhadap antibiotik kenamisin tanaman transforman. Daun tetap hijau menunjukkan bahwa tanaman tersebut tahan terhadap kenamisin, sedang daun yang berubah menjadi coklat menunjukkan tidak tahan. Daun tersebut direndam dalam larutan kenamisin 100 ppm selama 5-9 jam.

Gambar 7. Deteksi ekspresi gen GUS (β-glucurodinase) dan deteksi keberadaan gen GUS dengan teknik PCR pada transforman tanaman jeruk Kinkit. A. Deteksi pada ekstrak tunas, 1. Ekspresi gen GUS pada mutan CVPDr-s , 2. Tidak dideteksi adanya ekspresi gen GUS pada beberapa tunas walau tahan pada kenamisin, 3. Uji pada tunas kontrol (non-transformed). B. Deteksi gen GUS pada potongan tunas dalam mikrotiter. C. Deteksi dengan teknik PCR. 1. DNA dari tunas non transformed; 2. DNA dari tunas kenamisin resisten, tetapi ekspresi gen GUS negatif. 3. Sampel plasmid DNA dari pBl121;4 dan 5. DNA dari tunas transformed, dengan ekspresi gen GUS positif.

Gambar 8. Deteksi ekspresi gen GUS pada kecambah tanaman Arabidopsis yang ditransformasi secara in planta. Dengan cara ini dihasilkan tanaman transforman yang partial (chimera). Warna biru menunjukkan ekspresi gen GUS. Bagian tanaman yang berwarna biru menunjukkan sel-sel tanaman pada bagian tanaman tersebut mengandung gen gus tertransformasi.

Gambar 9. Kalus dan tunas (shoots) yang dihasilkan melalui kultur in vitro. A dan B pertumbuhan kalus pada media MTO. C, kalus yang terbentuk sebelum pertumbuhan tunas. D, Pertumbuhan rumpun tunas pada media MTOK. E, Pertumbuhan rumpun tunas pada media. F dan G tunas yang ditanam secara individu pada media dengan antibiotika, kanamisin. H, tunas nontransformed yang tidak dapat hidup pada media dengan kanamisin (menguning, layu, dan mati).

Gambar 10. Alat / mesin untuk analisis sequence (urutan nukleotida) DNA (kiri). Dengan menggunakan alat ini dalam sekali analisis untuk satu sampel dapat dibaca sekitar 700-900 nukleotida. Alat dengan tipe lebih baru dapat membaca urutan nukleotida DNA mencapai diatas 1000 nukleotida. Beberapa jenis alat/mesin untuk analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) (kanan).
Transformasi Genetik Tanaman Jeruk Tahan CVPD

1. Bakteri dan Kondisi Kultur
Bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: Bakteri Escherichia coli HB 101 digunakan untuk membawa plasmid pRK2013, suatu helper plasmid yang digunakan dalam proses konjugasi triparental mating (Wirawan and Kojima, 1996). Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 dengan Ti plasmid biner, pAL4404 dan pBI121 atau pMW24 digunakan dalam transformasi genetik tanaman jeruk kinkit dan karatachi. Bakteri dipelihara pada media minimal LB, YEB atau AB. Konsentasi antibiotik yang digunakan dalam media (mg/liter) adalah sebagai berikut: kanamisin (100), ampisilin (50) dan karbenisilin (500) (Kang, et al, 1992; Kang, et al, 1994).
2. Transformasi Genetik Melalui Kultur in vitro
Eksplan jeruk kinkit atau karatachi yang digunakan adalah potongan daun, potongan batang (internode stem), potongan buah muda (immature fruit), biji dan potongan kecambah steril. Media yang digunakan dalam kultur jaringan ini adalah media LS, MTO+ atau MSO+ (untuk penumbuhan kalus) dan media MS104 atau MTOK (untuk penumbuhan shoot/ perbanyakan) dengan 0,4 % agar. Untuk menumbuhkan akar digunakan rooting media yang merupakan media MSO dengan 0,3 % agar dan dengan kanamisin dan karbelisilin. Sedangkan jenis agar yang digunakan dalam penelitian ini adalah agar Gellum Gum.
Bagian tanaman yang masih segar pertama-tama dicuci dengan aquades, kemudian direndam pada larutan sodium hipokhlorida 5 % dan 1 % masing-masing secara berurutan selama 5 menit. Setelah itu potongan tanaman ini dicuci dalam aquades steril sebanyak 3 kali. Air yang masih melekat pada bagian tanaman tersebut dihilangkan dengan cara menempelkannya pada kertas tissue steril. Setelah cukup kering bagian tanaman tersebut dipotong-potong. Untuk ruas batang (internode stem) dan daun potongan dibuat sangat pendek yaitu antara 0,2 – 0,5 cm. Sedangkan untuk buah muda (immature fruit), satu buah dapat dibagi menjadi 3 – 4 potongan. Untuk eksplan dari kecambah steril tidak dilakukan sterilisasi lagi. Setelah dilakukan inokulasi dengan A. tumefaciens strain LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24), potongan-potongan tanaman tersebut ditaruh/ditanam pada media yang sesuai dalam botol.
3. Transformasi Genetik secara in planta
Dengan metode ini bibit tanaman dikecambahkan dari biji. Inokulasi dapat dilakukan melalui embryo biji atau melalui pucuk kecambah tanaman jeruk kinkit atau karatachi atau nipis tanpa biji. Transformasi melalui embryo dilakukan dengan menyuntikkan atau melukai embryo dengan jarum suntik lalu diolesi dengan A. tumefaciens strain LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24) yang dikultur pada media LB agar dengan kanamisin 100 ppm. Biji yang telah diinokulasi ditanam pada media tanah steril dan dipelihara dalam rumah kaca. Transformasi melalui meristem tunas, dilakukan dengan memotong pucuk muda tunas atau kecambah yang ditanam pada media tanah steril, lalu pada ujung tanaman yang telah terpotong tersebut diolesi dengan A. tumefaciens strain LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24) yang dikultur pada media LB agar dengan kanamisin 100 ppm. Tanaman yang telah diinokulasi dipelihara dalam rumah kaca untuk dilakukan pengamatan dan seleksi transforman. Transformasi genetik dengan sistem in planta, menghasilkan tanaman transforman yang sebagian besar adalah chimera (tidak seluruh sel atau jaringan tertransformasi).
4. Mekanisme transformasi genetik A. tumefaciens
Plasmid pBI121, pIG121 atau pMW24 yang dipelihara dalam sel A. tumefaciens 4404 (pAL4404) digunakan untuk mentransformasi sel-sel tanaman jeruk kinkit atau karatachi. Mekanisme molekuler proses transfer gen dengan vektor A. tumefaciens dapat diringkas sebagai berikut: fragmen DNA NptII-GUS dipotong menjadi DNA satu rantai (ssDNA) yang kemudian pada ujung 5′ dari ssDNA tersebut berikatan protein VirD2 dan protein VirE2 menjadi selubungnya (coat protein). Kompleks DNA-protein ini disebut T-kompleks yang akan bergerak, dimana pada periplasma protein AcvB akan berikatan pada komplek ini dan mentransfernya keluar sel A. tumefaciens dan masuk ke dalam sel tanaman.
Fragmen NptII-GUS berintegrasi ke dalam genom sel tanaman sehingga tanaman transgenik ini dapat tumbuh pada media dengan kanamisin dan ekspresi gen GUS juga dapat dideteksi dari tanaman transgenik ini.
Plasmid pMW24 mempunyai konstruksi yang sama dengan pBI121, tetapi gen GUS pada pBI121 diganti dengan gen acvB. Keberadaan gen acvB ini diperlukan untuk meningkatkan frekuensi transformasi, karena protein AcvB berperan dalam proses transfer DNA ke dalam sel tanaman.
5. Tahapan Kerja Transformasi in vitro
Transformasi tanaman jeruk kinkit dilakukan sebagai berikut. Sel-sel A. tumefaciens yang dikultur selama 18 jam pada media LB atau AB (cair) dengan kanamisin 100 ppm dipanen dengan sentrifugasi, kemudian sel-sel bakteri ini dicuci 3 kali menggunakan media MS cair (steril). Sel-sel bakteri ini kemudian disuspensi dalam media MS cair dan siap digunakan untuk mentransformasi sel-sel tanaman jeruk kinkit atau karatachi pada media. Inokulasi bagian-bagian tanaman jeruk kinkit atau karatachi sebagaimana dijelaskan di atas dapat dilakukan dengan dua cara yaitu: 1. dengan merendam selama 5 – 10 menit potongan-potongan tanaman tersebut dalam suspensi Agrobacterium sebelum ditempatkan pada media kultur jaringan, atau, 2. dengan menempatkan terlebih dahulu potongan-potongan tanaman tersebut ke dalam media kemudian bagian tanaman yang terpotong ditetesi 2 – 3 tetes suspensi A. tumefaciens menggunakan jarum suntik.
Inokulasi juga dilakukan menggunakan kultur padat A. tumefaciens, LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24). Biakan bakteri pada media padat ini diambil menggunakan tusuk gigi steril lalu dioleskan pada ujung potongan atau bagian eksplan yang dilukai.
Eksplan yang telah diinokulasi ditanam pada media (dalam botol) kemudian dipelihara pada suhu 25 – 28 0C selama 16 jam dalam penerangan dengan cool-white fluorescent light (Gynheung, 1985; Moore, et al, 1992). Setelah 5 – 7 hari potongan-potongan tanaman yang tetap hijau dipindahkan ke media yang mengandung kanamisin 100 ppm untuk menyeleksi sel-sel yang tertransformasi dan karbenisilin 500 ppm untuk mencegah pertumbuhan vektor Agrobacterium pada media. Pertumbuhan kalus dan atau tunas diamati secara periodik sampai beberapa minggu.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa eksplan dari potongan buah muda hanya sanggup membentuk kalus dengan tingkat keberhasilan yang sangat rendah. Kalus yang dihasilkan ini tidak dapat bermultiplikasi membentuk tunas (shoot). Sedangkan eksplan dari potongan batang muda (internode stem), merupakan eksplan terbaik untuk menghasilkan tunas atau kalus, dan kegagalan karena kontaminasi sangat kecil.
Media terbaik untuk pertumbuhan tunas adalah MTOK, dan untuk pertumbuhan kalus adalah MTO+ atau MSO+. Eksplan yang ditanam pada media MTOK, umumnya membentuk kalus (pada minggu 1-2) dan kemudian dari kalus ini akan tumbuh tunas yang banyak (bergerombol). Untuk eksplan yang ditransformasi dengan A. tumefaciens, seleksi transforman akan baik dilakukan setelah pertumbuhan tunas ini. Tunas yang tumbuh bergerombol tersebut, kemudian ditanam secara individu pada media MTOK dengan 100 ppm kanamisin. Tunas yang bertahan tumbuh adalah tunas yang telah mengalami transformasi (transforman). Tunas tanaman jeruk yang dihasilkan kemudian secara bertahap dipindahkan dan dipelihara dalam media tanah steril untuk kemudian diuji ketahanannya terhadap serangan penyakit CVPD. Tanaman yang menunjukkan gejala serangan CVPD kemudian diseleksi dan dilakukan analisis lanjutan yaitu dengan analisis PCR untuk mendeteksi keberadaan patogen CVPD pada tanaman yang menunjukkan gejala tersebut.

6. Analisis Jaringan Transforman
Tunas yang dihasilkan dari kultur jaringan yang telah diseleksi menggunakan media yang mengandung kanamisin 100 ppm diuji lebih lanjut apakah telah benar-benar tertransformasi oleh fragmen DNA dari plasmid pBI121 atau pMW24. Pengujian ini dikerjakan baik dengan cara uji aktivitas gen GUS maupun uji PCR dengan mengamplifikasi fragmen DNA gen GUS (1,3 kb) menggunakan template DNA yang diisolasi dari daun atau potongan tunas yang telah digunakan dalam uji aktivitas gen GUS sebelumnya.
Adapun uji aktifitas gen GUS dilakukan sebagai berikut: ujung batang tunas yang dihasilkan dipotong pendek kemudian segera ditempatkan dalam microtiter plate yang berisi 23 µl pewarna 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide (1 mg/ml) dalam buffer 0,1 M NaPO4, pH 7,0 dengan 10 mM Na2EDTA pada setiap well-nya (Jefferson, 1987). Potongan tunas ini direndam selama 4 – 5 jam pada suhu 37 0C karena perendaman yang lebih lama akan menghasilkan banyak kesalahan pada hasil. Jaringan tanaman ini kemudian dicuci dengan 100 µl campuran 95 % etanol dan asam asetat (3:1, v/v). Bagian-bagian yang mengandung aktivitas gen GUS akan terlihat dengan jelas. Sebagai kontrol negatif digunakan jaringan yang tidak ditransformasi.
Bagian tanaman yang tidak diinokulasi dengan Agrobacterium (non-transformed plant) pada kenyataannya tidak dapat tumbuh membentuk kalus atau tunas pada media dengan kanamisin, atau kalaupun tunas dapat tumbuh tetapi tidak dapat bertahan lama dan kemudian mati. Pada tanaman jeruk kinkit untuk lebih memberikan bukti bahwa tunas yang dihasilkan benar-benar tunas yang tertransformasi, dilakukan uji lanjutan yaitu uji aktifitas enzim b-glucuronidase (GUS). Ditemukan 63.8 % tunas yang menunjukkan aktifitas enzim b-glucuronidase (GUS+).
Menurut Jordan and McHughen, 1988, banyaknya tunas atau tanaman yang tahan hidup pada media dengan kanamisin dapat disebabkan oleh adanya proteksi dari sel yang tertransformasi kepada sel yang tidak tertransformasi sehingga sel-sel yang tidak tertransformasi dapat tumbuh pada media dengan kanamisin. Hal lain yang kami pikirkan adalah adanya kemungkinan sel-sel bakteri vektor (A. tumefaciens) yang masih bertahan hidup pada media yang dapat menonaktifkan kanamisin pada media, sehingga sel yang tidak tertransformasi dapat tumbuh.
Beberapa tanaman yang menunjukkan aktivitas GUS+ dianalisis lebih lanjut dengan PCR menggunakan sekuen (susunan) gen GUS sebagai primer. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa semua tanaman yang diuji, positif mengandung gen GUS yang berarti bahwa semua tanaman yang diuji adalah tanaman yang telah tertransformasi (transformed plants). Tanaman tranforman yang dihasilkan secara bertahap ditanam di pot dengan media tanah steril untuk kemudian dipelihara dalam rumah kaca dan siap untuk diuji ketahanannya terhadap serangan penyakit CVPD.
Uji Ketahanan Tanaman Transforman terhadap Serangan Penyakit CVPD
Uji ketahanan tanaman transforman terhadap serangan penyakit CVPD dilakukan untuk menyeleksi tanaman transforman jeruk kinkit yang berubah menjadi peka terhadap CVPD atau disebut tanaman CVPDr-s. Tanaman CVPDr-s menunjukkan bahwa tanaman tersebut telah mengalami mutasi pada gen yang berperan dalam ketahanan terhadap penyakit CVPD. Sehingga untuk mendapatkan gen tahan penyakit CVPD (gen CVPDr) dapat dilakukan dengan mengisolasi fragmen DNA yang termutasi pada tanaman CVPDr-s.
Uji ketahanan tanaman transforman terhadap serangan penyakit CVPD dilakukan dengan penularan penyakit CVPD menggunakan serangga vector D. citri. Tanaman diletakkan dalam kurungan dan diberikan beberapa ekor serangga vector yang infektif (yang mengandung bakteri penyebab penyakit CVPD). Pengamatan dilakukan selama 6-12 bulan.
Pengamatan terhadap 767 tanaman transforman yang diuji ketahanannya terhadap CVPD, ditemukan ada 2 tanaman yang menunjukkan gejala yang sangat mirip gejala serangan penyakit CVPD. Analisis PCR yang dilakukan terhadap gejala serangan ini menunjukkan hasil yang positif, artinya tanaman transforman jeruk kinkit ini memang terserang penyakit CVPD. Analisis PCR terhadap gejala serangan ini dilakukan 2-3 kali untuk lebih meyakinkan dan mendapatkan konsistensi hasil sambil menunggu tanaman menjadi lebih besar. Hasil pengulangan ini menunjukkan bahwa gejala serangan penyakit yang diamati memang benar serangan penyakit CVPD. Tanaman terebut kemudian dianalisis lebih lanjut untuk mengisolasi fragmen DNA termutasi.
Isolasi fragmen DNA termutasi dengan metode Inversed PCR
Fragmen DNA pemutasi, NptII-GUS, dari plasmid pBI121 yang terselip ke dalam genom mutan tanaman CVPDr-s dilacak dengan metode IPCR menggunakan sekuen dari fragmen NptII-GUS sebagai primernya. Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer yang pernah kami gunakan pada penelitian menggunakan tanaman Kalanchoe (cocor bebek) dan mulbery yang dapat berhasil dengan baik. Sekuen primernya adalah sebagai berikut ;
F : 5′-AGA GGC TAT TCG GCT ATG AC -3′
R : 5′-GAT AGT GAC CTT AGG CGA CT -3′.
Total DNA diisolasi dari bagian tanaman CVPDr-s yang telah dikonfirmasi seperti di atas. DNA ini kemudian dipotong dengan endonuklease yang site-nya tidak terdapat pada fragmen NptII-GUS (pada penelitian ini digunakan EcoRI). Setelah itu dilakukan “self ligation” terhadap potongan-potongan DNA tersebut sehingga didapatkan berbagai ukuran DNA sirkular. Salah satunya adalah potongan DNA yang membawa fragmen NptII-GUS. Tahap selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA yang membawa fragmen NptII-GUS dengan IPCR menggunakan primer seperti tersebut di atas. Dengan teknik IPCR ini pembacaan terjadi secara terbalik yaitu mengarah keluar dari fragmen NptII-GUS sehingga amplifikasi akan menghasilkan flanking DNA dari tanaman CVPDr (jeruk kinkit) dengan hanya fragmen kecil DNA dari sekuen NptII-GUS.
Strategi Pengklonan (cloning strategy)
Fragmen DNA yang teramplifikasi yang mengandung flanking DNA dari tanaman CVPDr (jeruk kinkit) dengan fragmen kecil DNA dari sekuen NptII-GUS kemudian diklon pada plasmid pUC18. Strategi pengklonannya dilakukan sebagai berikut: pertama, dilakukan karakterisasi terhadap sisi potongan endonuklease (endonuclease restriction site) pada fragmen tersebut. Pada penelitian ini digunakan EcoRI, BamHI, dan Sac I. Pemotongan dengan Sac I ternyata menghasilkan fragmen ini relatif utuh (fragmen terpanjang, sehingga pengklonannya pada vektor plasmid pUC18 dilakukan pada sisi pemotongan SacI).
Ligasi (penyambungan fragmen DNA) dilakukan pada suhu 16 0C selama 2 jam – semalaman menggunakan enzim ligase (produk Takara). Transformasi dilakukan dengan menggunakan compitent cell, Escherichia coli JM109. Sebanyak 5 µl DNA yang telah diligasi, dicampurkan ke dalam 100 µl sel kompiten kemudian ditaruh dalam air-es selama 30 menit, lalu diinkubasi pada suhu 42 0C selama 45 detik sebelum ditambahkan 1 ml media SOC. Kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam, untuk selanjutnya dikultur pada media agar LB yang mengandung 50 ppm ampisilin.
Deteksi dan Isolasi wild type target DNA (Gen CVPDr )
Deteksi dan isolasi fragmen wild type target DNA serta konfirmasinya dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer yang dibuat berdasarkan sekuen partial dari flanking DNA yang telah diisolasi sebelumnya. Berdasarkan sekuen flanking DNA ini dirumuskan tiga sekuen primer yang disebut; primer 1, primer 2, dan primer 3. Total DNA dari tanaman induk, diisolasi kemudian dilakukan analisis PCR.
Program PCR yang digunakan adalah sebagai berikut; Denaturation pada suhu 94 0C selama 30 detik, annealing pada suhu 60 0C selama 30 detik dan extention pada suhu 72 0C selama 90 detik serta menggunakan siklus ulangan 26 kali. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dapat dilakukan pengulangan setelah selesai satu tahap program (double PCR).
Menggunakan ketiga primer tersebut diatas dihasilkan tiga produk PCR dengan ukuran yang berbeda, yaitu masing-masing 700 bp, 1100bp dan 841 bp. Penelitian ini juga menemukan bahwa tanaman jeruk keprok Tejakula tidak mengandung ke tiga fragmen DNA tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa gen untuk ketahanan terhadap CVPD tidak terdapat pada jeruk Tejakula
Hibridisasi Southern Blot
Konfirmasi terhadap produk PCR di atas dilakukan menggunakan metode Southern Blot. Semula cara ini direncanakan sebagai alternatif cara isolasi wild-type target DNA dari tanaman CVPDr (kinkit) namun kemudian diyakini perlu dilakukan untuk konfirmasi terhadap hasil yang telah diperoleh menggunakan metode PCR. Fragmen DNA, potongan EcoRI dari flanking DNA atau produk PCR di atas, dilabel dengan 32P digunakan sebagai probe untuk mendeteksi keberadaan fragmen tersebut pada tanaman induk (kinkit dan karatachi). Total DNA dari ke dua tanaman induk , kinkit dan karatachi, diisolasi, kemudian dipotong menggunakan EcoRI, lalu fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dipisahkan pada elektroforesis agarose gel, dan kemudian diblot dengan membran nylon menggunakan sistem Southern blotting, selama 16 jam atau overnight. Buffer yang digunakan dalam blotting ini adalah buffer SSC (Sambrook, et al, 1989) .
Blotting total DNA dari ke dua tanaman induk , kinkit dan karatachi, terhibridisasi oleh DNA probe yang digunakan, dan menunjukkan hibridisasi band yang sangat jelas. Sedangkan sampel DNA dari tanaman jeruk keprok Tejakula tidak terhibridisasi. Hal ini menunjukkan bahwa jeruk keprok Tejakula tidak mengandung fragmen DNA yang berhubungan dengan ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit CVPD. Hasil penelitian ini sekaligus mengkonfirmasi hasil penelitian menggunakan analisis PCR.
Overekspresi pada Sel Escherichia coli dan Pembuatan Tanaman Jeruk Transgenik
Sekuen DNA terhadap fragmen 1100 bp yang dihasilkan tidak dapat menentukan adanya Open Reading Frame (ORF) yang meyakinkan, sehingga diupayakan untuk mendapatkan fragmen DNA yang lebih panjang. Penelitian menggunakan teknik running primer dan dikombinasikan dengan teknik Southern Blotting telah berhasil diisolasi fragmen DNA dengan ukuran 2500 bp. Fragmen DNA ini kemudian diklon dalam plasmid vektor pT7 Blue pada sisi pengklonan NdeI. Dua ORF ditemukan setelah fragmen DNA 2500 bp ini disekuen. Klon fragmen DNA 2500 bp dengan dua ORF ini pada plasmid vector pT7 Blue diberi nama pWR27 yang telah didaftarkan Hak Patennya di Ditjen HKI melalui Program Oleh Paten Kementerian Riset dan Teknologi RI, atas nama I Gede Putu Wirawan.
Uji overekspresi klon DNA ini dalam sel E. coli menghasil dua molekul protein dengan ukuran 17 dan 20 kDa. Penemuan ini menunjukkan bahwa ke dua ORF yang ditemukan pada sekuen DNA yang diklon adalah dua buah gen yang aktif dan berperan dalam mekanisme ketahanan tanaman jeruk terhadap serangan penyakit CVPD.
Fragmen DNA yang membawa gen diklon ulang (subklon) pada plasmid vektor biner pBI121 dan dimasukkan kedalam sel Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 dengan metode triparental mating. A. tumefaciens merupakan bakteri Gram negatif yang sangat baik digunakan sebagai vektor dalam membawa gen atau fragmen DNA tertentu ke dalam genom tanaman. Setelah klon ini berada dalam sel A. tumefaciens maka transformasi genetik ke dalam sel tanaman jeruk komersial (jeruk keprok atau siem atau lainnya) dapat dilakukan. Transformasi genetik untuk menghasilkan tanaman jeruk transgenik tahan penyakit CVPD dapat dilakukan dengan berbagai metode baik melalui kultur in vitro (kultur jaringan) maupun melalui metode in planta. Transformasi in planta dapat dilakukan dengan menginokulasi mata tunas yang tumbuh pada pembibitan dengan sistem grafting (penempelan). Sebagian tanaman transgenik yang dihasilkan akan berifat chimera, yaitu tidak keseluruhan bagian tanaman tertransformasi. Tetapi cara in planta ini sangat sederhana, murah dan dengan keberhasilan yang cukup tinggi (lebih dari 17 %).

Gambar 11. Skema metode isolasi wild type target DNA dengan teknik IPCR dan strategi pengklonan pada plasmid vektor. Click disini untuk animasi gambar 5.

Gambar 12. Gambar Deteksi, isolasi dan pengklonan flanking DNA termutasi pada transforman tanaman jeruk kinkit yang berubah menjadi peka terhadap serangan penyakit CPVD. A. Produk IPCR, B. Kloning flanking DNA termutasi pada vektor PUC18. ND = non-digested.

Gambar 13. Deteksi dan isolasi wild type target DNA yang mengandung gen untuk ketahanan terhadap serangan CPVD. 1 dan 3 sampel DNA jeruk kinkit; 2. ampel jeruk keprok Tejakula. 4,5 dan 6, jeruk Karatachi.

Gambar 14. Deteksi dan isolasi fragmen DNA yang mengandung gen untuk ketahanan terhadap penyakit CPVDr dari tanaman jeruk kinkit.

Gambar 15. Overkspresi klon gen CPVDr pada plamid pWR27 dalam sel E. coli. Dua molekul protein dengan ukuran 17-20 kDa terdeteksi (lajur 1-3. Sedangkan lajur 4-7 sampel protein dari sel E. Coli yang hanya membawa plasmid vector tanpa gen CPVDr)

Gambar 16. Klon Gen CPVDr dalam sel Escherichia coli dikultur pada media stok gliserol dan disimpan pada suhu -80 derajat C.

Gambar 17. Uji ketahanan terhadap penyakit CPVD pada tanaman jeruk transgenik. A Tanaman jeruk control (terserang penyakit CPVD). B. tanaman jeruk transgenic membawa gen CPVDr(tidak terserang penyakit CPVD)

Gambar 18. Beberapa tanaman transgenik hasil transformasi genetik menggunakangen CPVDr. Tanaman-tanaman ini berjumlah sekitar 200 pohon sedang diuji ketahanannya terhadap penyakit CPVD dan uji perubahan fenotipe, genotype dan kelayakan pangannya.
Diposting oleh di
Label: